O método Kjeldahl é o método de referência internacional usado em alimentos e rações, sendo o ensaio mais comumente utilizado em isolados de proteína. A amostra do alimento é digerida por aquecimento na presença de ácido sulfúrico (agente oxidante) e converte qualquer nitrogênio no alimento (exceto aquele que está na forma de nitratos ou nitritos) em amônia (Kjeldahl, 1883).
O gás amônia não é liberado em uma solução ácida porque a amônia está na forma do íon amônio (NH4+) que se liga ao íon sulfato (SO42-) e, portanto, permanece em solução. A solução é então tornada alcalina pela adição de hidróxido de sódio (em concentração próxima a 40% m/v), que converte o sulfato de amônio em gás amônia (Gunathilake, 2015; Kjeldahl, 1883).
O baixo pH da solução converte o gás amônia no íon amônio e, simultaneamente, converte o ácido bórico no íon borato. O teor de nitrogênio é então estimado pela titulação do borato de amônio formado com ácido sulfúrico ou clorídrico padrão, usando um indicador adequado para determinar o ponto final da reação (Gunathilake, 2015; Kjeldahl, 1883).
As reações que ocorrem em cada etapa estão descritas a seguir:
· 1ª fase - Digestão: quebra das proteínas, aqui o ácido sulfúrico ou H2SO4 funciona como o agente oxidante que quando combinado com altas temperaturas quebra as proteínas; e o sulfato de cobre ou CuSO4 e o sulfato de potássio K2SO4 irão agir como catalisadores, onde o segundo vai evitar a evaporação do ácido sulfúrico aumentando o seu ponto de ebulição.
· 2ª fase - Destilação: Os sais de amônio quando em hidróxido de sódio ou NaOH liberam a amônia; e o ácido bórico quando reage com a amônia irá formar o metaborato de amônio de acordo com as equações 1, 2, 3 e 4.
H3BO3 ßà H2O + HBO2 + indicador (roxo)
(ácido bórico) (água) (óxido de boro)
(NH4)2SO4 + NH4HSO4 + NaOH à NH3 + Na2SO4 + H2O
(Sulfato de amônia) (bissulfato de amônio) (hidróxido de sódio) (amônia) (sulfato de sódio) (água)
NH3 + H2O + HBO2 à NH4BO2 (verde) + H2O
(amônia) (água) (óxido de boro) (metaborato de amônio) (água)
· 3ª fase – Titulação onde irá ocorrer a seguinte reação
NH4BO2 + HCl à NH4Cl + HBO2 (roxo) + H2O
(metaborato de amônio) (ácido clorídrico) (cloreto de amônio) (óxido de boro) (água)
Tal método ainda carece de seletividade analítica para proteína porque mede a proteína com base no teor total de nitrogênio e não distingue o nitrogênio da proteína, aminoácido livre ou outros compostos nitrogenados presentes na amostra, como nitrogênio inorgânico, alcaloides, glicosídeos cianogênicos, amidas, sais de amônio, glicosídeos nitrogenados, porfirinas, gorduras, hormônios, ácidos nucleicos, entre outros. Portanto, o fator de conversão de 6,25 é inexato e resulta em superestimação da proteína total (Gunathilake, 2015).
Referências
KJELDAHL, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern. Fresenius’ Zeitschrift für analytische Chemie, v. 22, n. 1, p. 366–382, 1 dez. 1883.
GUNATHILAKE, K. G. T. The comparative compositional analysis and the evaluation of functional properties of protein isolates of selected locally available low fat legume varieties (mung bean and cowpea). Degree of Bachelor of Science (Special) in Food Science and Technology —[s.l.] University of Sri Jayewardenepura , 2015.